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皮胶原的模拟:模拟层次结构的挑战
2019-01-16

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胶原是哺乳动物体内含量最丰富的蛋白质,广泛分布于皮肤等结缔组织中。在18世纪以前,曾出现海员长期航海不携带新鲜水果和蔬菜造成维他命C的短缺,致使胶原在体内的合成中断,使船员染上坏血病而死亡。由此可见,胶原对健康生命至关重要,然而这往往得不到重视。

很久以来,动物的皮肤就是人类获取胶原的重要原材料。几千年以前,人类开始发现鞣制能改善动物皮的性能。1991年,在意大利Oetztal发现冰人Oetzi具有里程碑式的意义。公元前3200年,Oetzi因受伤死于阿尔卑斯山,在此冷藏了5300年之后,他的衣着和器械仍保持完好无损。他的皮革用品之一是由外层的皮革(熊皮、牛皮和鹿皮),植物纤维和内层的稻草等材料复合而成的鞋,以抵御严寒和防止石块划伤脚掌。显然,原始人就跟现代人使用制革技术一样,凭借他们掌握的方法来改善材料的性能。

鞣制增强了皮革的耐水、耐膨胀和耐腐蚀性[1]。鞣皮有很多方法,但至今鞣制效果最好的是用三价铬盐的铬鞣法,铬鞣法是在19世纪中叶发现的。另外一种鞣制方法是植鞣法,它是用存在于某些植物的皮和根部的多酚进行鞣制,这种方法就算没有几千年也有数百年的历史。Oetzi的皮革用品是鞣制过的,说明当时的文明程度较高。                                                          

皮革是一个400亿美元的产业,皮革化学品每年大约销售30亿美元。为了提高和优化产品以适应现代市场的需求,正在进行的产品研发非常关键。过去100年以来的研究使我们对皮革生产的各个方面有了更进一步的了解,但仍然缺少在分子水平上对鞣制效应和皮革化学品与胶原分子的作用的详细理解。这种理解能大大促进更为理性地设计和研发化学品。其中一个目标是用环境友好的化学品取代铬盐,同时具备铬盐良好的鞣制效应。

自古以来皮革就是一种神奇的材料,能够与现代合成材料相媲美。皮革具有韧性,耐磨、防水、透气,这些性能都是由它本身的层次结构决定的。所谓的‘层次结构’是指:亚结构组合在一起构成具有不同物理和机械性能的更高一级的结构。例如,原胶原组成微纤维,微纤维构成胶原纤维,胶原纤维构成了皮革。皮革的组织结构和胶原纤维已经通过光学和电子显微镜(图2)在纳米尺度上进行了很好的研究。许多皮革化学品和最终产品的相互作用也能够在这个尺度上进行研究和优化,如表面涂饰等。为了从分子水平上研究胶原的结构,高分辨率电子显微镜(SEMTEM)、原子力显微镜(AFM)、X射线结晶学、蛋白质测序和理论方法起着关键作用。

型胶原是由线形的三股螺旋构成,类似于三股绳。每个三股螺旋由两条相同的a1链和一条a2链组成。这种结构是由R. N.Ramachandran20世纪50年代首次发现的[2]。每个型胶原分子长约为1000个氨基酸,由GLY-X-Y的重复单元构成,即每三个氨基酸中就有一个甘氨酸。这一点对于重复的螺旋结构的形成很重要。GLY-X-Y重复单元中的XY是由大约10%的脯氨酸、10%的羟脯氨酸、10%的丙氨酸以及其它常见氨基酸构成。胶原分子的末端是由短的、不规则的端肽构成。羟脯氨酸由脯氨酸和抗坏血酸维生素C协同产生,它的作用是通过分子间而不是分子内氢键作用使纤维结构牢固。脯氨酸能够增强分子链的刚性,但不能增加分子的稳定性。原胶原分子与相邻的分子沿纤维轴有一定位移,这反映在电子显微镜上是规则的条纹。2006年,Orgel[3]发表了一种型胶原分子完整的晶体结构,包括端肽。这种晶体结构表明原胶原分子在径向上是一种有趣的堆积,在纵切面上呈六边形分布Orgel结构证实了Wess[4]1998年报道的堆积类型。不同类型胶原的氨基酸排布已被诸如SwissProtPIR等序列数据库[5]收录。

单个的原胶原分子太长以致于当前不能被完全模拟。然而,短的片断已被模拟[6-10]。自20世纪80年代以来,由按Smith五边形模型排列的5个(Gly-X-Y6-12构成的短的微纤维已用计算方法进行了研究[11-16]DochertyBrown等的早期研究是通过力场能量最低技术和半经验量子力学进行的,重点在于研究原胶原分子的结构和分子之间的侧链相互作用,并用几何原理和力场方法检测了酸性侧链基团和铬配合物之间可能的相互作用。这些研究为理解诸如氢键等分子内和分子间的相互作用以及结合水的作用提供了基础。羟脯氨酸已被证实增强原胶原分子间,也就是微纤维的稳定性,而不是原胶原分子本身的稳定性。

铬盐是如何与胶原发生作用的问题已如上述进行了定性检测。为了更好地描述这个反应体系,需要诸如密度泛函理论等更加微妙的方法。据我们所知,当今的计算能力对包括铬盐在内的相关结构模拟是完全可行的,但没有去做。2003年,Parthasarathi等依据哈特里-福克方程和密度泛函理论发表了关于胶原三股螺旋稳定性的从头计算研究[17]。文章中,他们检测了不同GLY-X-Y重复单元在伸展和螺旋状态下的稳定性和自由能的差异。除了论文提供的详细信息以外,用于真实胶原分子的广泛适用性非常有限。

皮革化学家对鞣剂、浸酸盐、染料等化学品和胶原之间的作用非常感兴趣。因此,为了使理论模型与实验化学相关,必须对模型的概念进行延伸。CappelliMonti等报道了戊二醛和没食子酸与含有24GLY-X-Y重复单元的Smith胶原分子束之间的稳定性和相互作用,胶原分子所处的环境是戊二醛和水的混合物或没食子酸和水的混合物[18]。用分子动力学研究了戊二醛和没食子酸对胶原微纤维结构的影响。简言之,分子动力学的力场满足牛顿运动法则,故可以研究分子随时间和不同温度发生的变化。这个力场视分子为带电的球体,通过库仑力相互作用,具有键距、键角和转距。这些参数通过经验得以确定,使晶体结构和物理性能再现。CappelliMonti检测了水、戊二醛、没食子酸与胶原氨基酸之间的哪些作用力是优先的。这些小分子能够视为多醛和多酚鞣剂的模型,用来证实鞣剂与胶原侧链之间不同的相互作用。戊二醛是氢键受体,能够强烈地与氨基酸侧链反应,没食子酸既是氢键供体又是氢键受体,所以能够与更大部分的胶原表面进行反应。纯水最能摄动纤维结构,而戊二醛和没食子酸却使它稳定。

这项工作的后续已于2005年发表,作者研究了水、水和戊二醛、水和没食子酸等不同溶剂混合物对23个氨基酸长度的具有smith模型的相邻胶原分子束的影响,反应体系仍然在一个盒中进行[19]。构建了四种不同的双纤维模型,并在酸性和中性条件下用分子动力学进行研究。这两条胶原微纤维作用间距足够小,因此能够研究溶剂混合物对纤维之间的相互作用(主要是氢键)的影响。不同溶剂体系的影响和上述之前论文的研究结果一致。

显然,随着计算能力的增强和更多有效算法的增加,能够用分子动力学和量子化学手段进行研究的体系的大小和复杂程度在迅速扩张。2003年,BASF开始对皮革模拟感兴趣。那时,我们开始设计胶原微纤维的一种模型,具有如下要求a)一种立体周期模型,所以沿纤维轴向没有末端效应(我们没有模拟端肽,并忽略空白区域)。考虑相邻纤维的时候无须直接构建出来,这样提高了运算效率,允许我们增加纤维的大小。b)纤维直径应足够大以从纤维和溶剂的界面区分纤维本身以及周边的其他纤维。c)构造水盒以使纤维和纤维之间的作用在一维(X轴)上完整,并且纤维之间的其他方向上都有水。d)纤维应足够长,以允许皮革化学品的加入。在制革的操作条件下,肽链上的谷氨酰胺和天冬酰胺分别水解成谷

氨酸和天冬氨酸。2004年,我们报道了在pH1714的条件下用NAMD程序[20]对具有28个氨基酸长度的27个三股螺旋模型进行分子动力学模拟,通过质子化和相反电荷的离子确保电中性[21]。为了确认我们的模型,在恒定的电压和300K温度下运行MD模拟程序以检验中性分子的平衡密度。模拟盒的平衡密度为1.44g/cm3,这与实验数据1.35 g/cm3非常吻合。皮和皮以及动物和动物之间的平衡密度不同。对模型的进一步校正来自不同pH下膨胀的模拟以及用不同的盐(如NaClCaCl2Na2SO4)以及1%12%的尿素进行浸酸[22]。结果表明盐的添加不同程度上抑制了在低或高pH下的膨胀,就象实验室中能够预料的一样。我们发现硫酸根具有最强的抑制作用而不是氯离子,这与Hofmeister序列[23]一致,即盐和蛋白质的作用顺序为F-,SO42->HPO42->醋酸根>Cl->NO3->Br->ClO3-。在模拟的过程中,发现尿素集中在胶原表面,然而2ms时间不足以发现预料之中12%尿素的变性作用,需要更长时间的模拟才能看到。

对具有大的自由度的体系进行分子动力学模拟,模拟时间问题非常普遍。构象转变,大的迁移等等往往在千万亿分之一的时间尺度内发生,这是分子动力学所不能达到的。幸运的是实验方法在不断改进以克服这些缺点。Parinello课题组利用所谓的‘赝动力学’强迫分子覆盖在理想的相空间,这样为了研究的需要去提取相关的自由能[24-25]。对于胶原的模拟而言,运用赝动力学可以模拟聚合复鞣剂。我们研究了在pH=7的条件下添加聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸高分子对具有34个三股螺旋纤维模型的作用。聚甲基丙烯酸是一种复鞣剂,而聚丙烯酸不用作复鞣。聚甲基丙烯酸比聚丙烯酸更加疏水,刚性更好。然而它们的结构非常相似,问题在于是否能检测到不同并能解释它们鞣制性能的不同。

我们的模拟实验证明聚甲基丙烯酸由于它的刚性和较少的氢键,在胶原微纤维之间形成了更好的缓冲体系。然而聚丙烯酸与纤维形成了许多更强的氢键,使纤维靠得更近形成“羊皮纸”结构。需要更多的模拟来证实这些结论。在这些问题得以最后解决之前,即使运用赝动力学,仍然存在大量相空间需要覆盖。好消息是计算能力在不断提高,并且费用在不断下降,而且软件在不断优化以适应更高效率的并行计算。这些事实将使大量的基于linux系统的计算机能够运行诸如NAMD程序等高效代码,即使那些对高复杂体系感兴趣的小组织也有经济能力承受。